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基因枪法转基因技术的研究综述

转基因技术是指将一个或更多的目的基因导入受体中 ,使该基因在受体生物中得以表达 .随着植物基因工程技术的发展 ,20 世纪 80 年代末 ,一项新的基因转化技术———基因枪技术应运而生[ 1] .由于基因枪技术安全性好、效率高,其应用范围迅速从植物基因工程、动物基因工程扩大到基因治疗和基因免疫领域,使细胞的研究发展到在体操作.目前 ,已有基于基因枪技术的多种基因疫苗进入临床研究阶段.
 
1 基因枪技术产生的历史背景
 
转基因技术是基因工程技术(亦称重组 DNA 技术)的一个重要组成部分.基因工程技术以分子生物学等学科为发展基础, 使人类拥有了创造生物遗传物质新组合的能力.随着该项技术的日趋成熟与完善 ,研究领域迅速从**初的转基因植物扩大到转基因动物 .1990 年人类正式展开对基因诊断与基因治疗的研究 ,在基因工程的各相关领域, 尤其是基因免疫和基因治疗方面 ,取得了较大的进展, 从学术研究步入了应用研究的阶段.
 
基因转移技术面临的障碍主要是转移技术需要跨越细胞外和细胞内双层障碍 .在细胞外的转移过程中遇到的障碍有:DNA 在血浆中降解、网状内皮组织对于 DNA 的吸收、难以将 DNA 定位到特定的器官、转染为黏液所阻止等 ;细胞内的障碍包括 :溶酶体对 DNA 的降解作用、DNA 胞浆的稳定性以及 DNA 向质粒的移位等.基因枪技术克服了以往各种基因转化技术的局限, 使转基因技术进入了一个新的领域 .
 
2 基因枪技术的转化原理及影响基因转化效率的因素
 
2 .1  基因枪技术的转化原理
 
用包裹 DNA 的金属小颗粒轰击受体组织, 使 DNA 实现穿壁并被导入众多细胞中 ,称为“基因枪法”(或微粒轰击技术).包裹着 DNA 的金属粒加速到一个很高的速度后(通常需要部分真空以减少颗粒的速度损失)穿透受体组织,一般可以穿透 2 ~ 3 层细胞 .**初是利用爆炸力在枪管里推动一个大的塑料微粒载片 ,片上放有包裹着 DNA 的微粒悬液, 后来用一个中间有洞的板挡住高速运动的载片,载片上的微粒穿过洞进入装有受体组织的真空腔中 ,并且打入或者穿过运动路径上的目标组织 ,微粒上携带的外源 DNA 分子就可能进入细胞 ,并进行表达.基因枪根据驱动力可以分为 3 种基本类型.
 
(1)火药式基因枪是**原始的类型 ,由美国康乃尔大学 Sanford 等人于 1987 设计制造[ 2] .这种基因枪自使用以来已先后将外源基因导入到玉米、小麦和水稻等多种植物材料中 ,获得了瞬间的或稳定的表达 .它的主体由滑膛腔、真空轰击室和阻弹部件构成.塑料子弹的前端载有大量携带了外源目的基因的微弹, 当样品爆炸时,子弹带着微弹向下高速运动,**阻挡板时子弹被阻碍,其前端的微弹依靠惯性继续高速运动,击中轰击室的靶细胞.该装置的特点是,粒子速度主要通过货样的数量及速度调节器控制, 不能无级调控 ,可控程度低 .
 
(2)压缩气体型基因枪的动力系统以氦气、氮气和二氧化碳气驱动.一种方法是把载有外源目的基因的微弹悬滴在一张金属筛网上, 在高压气体的冲击下 ,射入受体靶细胞 ;另一种方法是把外源目的基因与微弹混合后雾化,再由高压气体驱动射入受体靶细胞, 这种系统的靶范围可精确控制到 0 .15 mm 左右 .
 
(3)高压放电型基因枪利用电加速器通过高压放电将微弹射入受体靶细胞,其特点是可无级调控, 通过调节放电电压来控制粒子的速度和入射速度 .
2 .2 影响基因转化效率的因素
 
2 .2.1 基因枪轰击参数 DNA 包裹和射击过程中的各种物理参数因基因枪类型不同而有所差别.以目前使用较为普遍的 PDS1000/He 型基因枪为例, DNA 包裹所用的金属粒子主要有金粒和钨粒 ,金粒形状较均匀,对受体细胞没有太大的损伤,转化效果较好.氦气的压力是决定金属粒子飞行速度的主要因素 ,压力过大会对植物细胞造成伤害, 压力过小, 金属粒子不能进入细胞 .PDS -1000/ He 型基因枪提供了不同压力类型的可裂膜 ,在使用中可根据不同的转化材料做出选择.此外 ,金属粒子大小、载体膜的位置和靶材料的位置等参数也与其他射击参数相互联系, 应根据实验具体设置 .
 
2 .2.2 微弹射程 微弹射程指基因枪挡板与靶细胞间的距离, 它是影响基因转化率的重要因素.①植物组织中只有特定的细胞具有再生能力 ,因此必须调节射程来转化这类细胞.在动力来源恒定时, 射程越短, 穿透力越大,对细胞的损伤也越大 ,因此必须根据受体材料选择合适的距离;②转化率与弹膛内的真空度呈正相关关系 ,但要考虑靶细胞对真空度的耐受性;③轰击次数对转化率也有影响, 适当的轰击次数有利于目的基因的表达, 轰击次数过多往往会使轰击细胞损伤严重, 降低转化率 ;④DNA 的纯度和浓度均会影响转化率.DNA 的纯度越高,转化效果越好,但 DNA 的浓度越高 ,越容易使微弹粘结成大凝结团而降低转化率,目前普遍采用的 DNA 浓度为 1 g/ L ;⑤氯化钙与亚精胺常用作 DNA 的沉淀剂,沉淀剂的浓度对转化率也有影响.Klein 报道氯化钙的**适宜浓度为 1 .9 ~ 2 .4 mol/L , 亚精胺的**适宜浓度为 7 .69 ×10-3 ~
 
76 .9×10-3  m ol/ L[ 2] .
 
2 .2.3 受体的生理因素 受体的生理因素主要指受体细胞或组织的生理状态 .一般认为, 生理活性高的组织或细胞有利于外源 DNA 的摄入与整合.选用再生能力强的外植体作为转化受体 ,在轰击前将受体预培养一段时间 ,可明显提高转化率 .另外 ,高渗和脱水处理可使细胞质壁分离,从而减少轰击后因细胞质溢出而导致的细胞损伤, 提高转化率[ 3 , 4] .
3 基因枪技术的应用
 
**早应用基因枪进行基因转化并获得成功的是 Klein 等人, 他们用基因枪转化洋葱表皮的细胞, 并获得了成功.后来 M cCabe 将目的基因包于钨粉上 ,电轰击大豆茎尖分生组织, 结果约有 2 %的组织通过器官发生途径获得再生植株 ,在子代中检测到了外源基因 .1989 年用气动式基因枪转化烟草等植物获得成功, 且得到了瞬时表达.大麦的转基因技术与其他植物相比发展较慢 ,Kartha 等[ 3] 用大麦的细胞和组织进行培养 ,检测到报告基因的瞬时表达 .基因枪技术还在禾谷类作物中得到广泛应用,克服了单子叶植物的遗传转化受农杆菌寄主限制的局限性.Gordon Kam m 等用基因枪技术将 GUS 报告基因和 PA T 选择性基因导入基因型为 A188 ×B73 的玉米胚性悬浮细胞系,**获得转基因玉米的可育植株 ,使转基因玉米技术受到很大的关注[ 5] .贾柿荣等用国产火药式基因枪实现了质粒 pBH21 对玉米花粉的转化, 经人工授粉, 获得了转基因植株[ 6] .
基因枪法不仅可用于直接轰击悬浮细胞系和花粉 ,还可以用来轰击单个细胞.Rasmussen 等利用氦动力基因枪 ,用含质粒 pBC -17 或 PBA R -GUS 的完整大肠杆菌 DH 5α和含质粒 pN Y 的根瘤农杆菌 A 208 轰击玉米细胞,获得数个瞬间转化体 ,其中有 6 个是稳定的[ 7] .基因枪技术在对水稻进行基因转化的应用中也获得了成功.Oard 首先应用该技术获得了转基因水稻的愈伤组织 ,检测到了 G US 基因的瞬时表达[ 2] .同年, Cao 用基因枪技术转化水稻成熟胚,成功获得了转基因水稻植株 .小麦是栽培面积**大的重要粮食作物 ,但却是**后一个获得转化成功的禾谷类作物.V asil 等**报道用基因枪技术将 GUS 基因和 Bar 基因转入长期培养的小麦胚性愈伤组织中[ 2] .
 
随着基因枪技术的不断成熟, 基因枪法从植物扩展到动物领域.Ellen F Fynau 等利用瞬时高压放电式
 
(electric spark discharge)基因枪,将裹在金粒表面的 pCM V/H 1 DNA 导入老鼠的腹部表皮细胞 ,获得抗致
 
命流行性感冒的同种亚型病毒的预防和免疫响应, 仅仅接受 0 .04 μg DNA 的老鼠, 就有 65 %的幸存率[ 8] ;
 
C live Woffendin 等用 BIO -RAD 公司制造的基因枪将pRSV/ TAR Rev M 10 导入人的 T 细胞中 ,导入后的第 10 天,G418 选择转染基因, 合成的 DNA 占到总体的 11 %~ 46 %, 表明使用基因枪进行的基因转移速度比逆转录病毒介导高约 10 倍[ 8] ;Lodw ell DL 等用基因枪将一种编码狂犬病毒糖苷糖蛋白的 DNA 病毒导入灵长目动物体内, 受 DNA 疫苗接种的猴子产生了抗体反应[ 8] ;Carod O Tacket 等利用 Powder eject 的 XR1 型粒子加速器将一种编码 B 型肝炎表面抗原的 DNA 疫苗 (DNA vaccine encoding hepatitis B surface antigen)导入志愿者的表皮细胞, 很长时间后这些试验者身上还维持着很高水平的 HbsA b 反应[ 8] .
 
基因枪技术的对象从植物扩展到非灵长类动物、灵长类动物 ,**后到人体的临床研究 ,结果表明,基因枪技术应用于基因免疫领域时操作简便 , DNA 用量少(仅为肌肉注射用量的 1/250 ~ 1/2 500), 效率高 ,无痛苦,适宜在体操作,尤其适于将 DNA 疫苗导入表皮细胞, 并能获得理想的免疫反应[ 8] , 是基因免疫以及基因治疗领域的一种**潜力的基因转移方法[ 9] , 也因此受到各界的广泛关注[ 10] .
4 基因枪技术的优缺点
 
基因枪技术的优点是 :
 
(1)无宿主限制,能转化任何植物 ,特别是那些由原生质体再生植株较为困难和农杆菌感染不敏感的单子叶植物 ,提高了禾谷类植物的转化效率.
 
(2)靶受体类型广泛,不受基因型的限制,适用于不同的物种以及同一物种的不同品种 ,能转化植物的任何组织或细胞 .
 
(3)可以转化线粒体 、叶绿体等植物的不同细胞器 .外源DNA 进入细胞质后很难穿过双层膜在细胞器,用基因枪技术转化这类细胞器 ,转化频率高, 重复性好, 是目前该领域研究中**常用和**有效的 DNA 导入技术 .
 
(4)可以快速获得**代种子,方法简便易行.基因枪转化法在无菌条件下用载有外源基因的金属颗粒轰击受体材料, 便可以进行筛选培养,不需要进行原生质体的制备分离与培养的繁琐工作 .
 
(5)可控程度高,采用高压放电或高压气体驱动 ,可根据实验需要, 将金属颗粒(载体)射入特定层次的细胞 ,提高了遗传转化的效率 .
 
基因枪技术的缺点是 : (1)基因枪轰击的随机性导致转化效率不高 .
 
(2)基因插入往往是多拷贝随机整合到受体基因组中 ,可能发生多种方式的重排. (3)同源序列能以 DNA -DNA 、DNA -RNA 、RNA -RNA 的方式相互作用, 导致转录或转录后水平
 
的基因沉默.
 
(4)轰击过程中可能造成外源基因的断裂, 使插入的基因成为无活性的片段. (5)出现非转化体或嵌合体的可能性较高.
 
(6)应用成本较高 .
 
5 基因枪转基因技术的发展前景
 
目前 ,作物基因工程正处于飞速发展时期 ,越来越多的转基因植物产品进入市场.人们可以利用基因枪技术转化培养特定农艺性状基因(如抗病、抗旱、抗寒、抗涝、抗虫、耐盐、耐药等)以及能够改良食品质量(高蛋白、高油酸、含维生素等)的基因作物 , 还可以利用该技术来开发和利用具有特定用途(如生物制药)的作物 .
同样 ,利用基因枪法获得转基因生物也具有广阔的发展前景.利用基因枪法转基因虽然成本较高 ,但如

第 4 期 卢 萍等:基因枪法转基因技术的研究综述 · 109 ·
 
果资源共享做得好, 尤其是随着科学技术特别是分子生物学技术的飞速发展,基因枪法的成本会不断下降,以往的发展已经很好地证明了这一点.另外, 基因枪法转基因在宿主细胞的选择方面无任何限制, 有着巨大的发展空间.例如,农杆菌法转基因受宿主细胞选择的限制较大 ,因而主要应用在双子叶植物的转基因中 ,但基因枪法无此限制.基因枪法在转基因植物、转基因药物、生物反应器、转基因动物组织器官移植、供体以及基因治疗和基因免疫方面均有广泛的应用,尤其对家禽、鱼类和昆虫的应用研究以及对乳腺生物反应器和昆虫杆状病毒构建的生物反应器的研究, 均显示了巨大的经济效益和社会效益.
 
目前 ,基因枪法转基因技术仍有许多有待解决的问题, 如对于基因枪应用的**佳条件的探索、进一步提高在大哺乳动物中的转染效率以及对基因枪转基因整个转移过程的微观机制的研究等, 还需要进行深入的探索 .
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