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农杆菌介导法与基因枪轰击法结合在植物遗传转化上的应用

自从 1983 年 Zambryski[ 1] 等利用根癌农杆菌
 
( A grobacterium tumf aciens) 介导法获得首例转基因植株以来, 植物基因工程的发展日新月异, 硕果累累, 一大批有价值的转基因植株已经或即将投入到实际应用中. 经过 20 年的探索磨砺, 转基因技术日臻成熟, 已形成了以农杆菌转化和基因枪转化技术为主体的两大植物转化系统[ 2] . 转化效率偏低是这两种方法普遍存在的不足之处, 然而就每一种转化体系来说又有自己的优点. 农杆菌转化是一种天然的 DNA 转移过程. 外源基因拷贝数低, 大多数单一位点整合, 遗传稳定性好. 而无宿主范围限制, 受体类型广泛则是基因枪转化的显著特点[ 3] . 近年来, 分子生物学家将农杆菌介导法和基因枪轰击法结合起来转化植物, 力图将二者优势互补, 提高转化效率,建立一套新的遗传转化途径, 并在一些植物中取得了成功.
 
1 农杆菌和基因枪的结合方法
 
农杆菌介导法和基因枪轰击法各有自己的优缺点[ 411] , 它们之间并不是相斥的; 相反, 通过结合两种方法的特性, 互相取长补短, 就有可能提高转化效率. 目前, 结合转化的途径主要有 3 种, 分别为农杆枪法( A grolistic) 、基因枪轰击/ 农杆菌感染法、金粉或钨粉包裹菌体细胞作为微弹轰击法.
1. 1 农杆枪法
 
农杆枪法是 1996 年由 Hansen 和 Chilto n[ 12] 所
 
采用. 并将它命名为 Agr olistic 转化法. 该方法以基因枪的共转化与根癌农杆菌介导的遗传转化为理论基础. 基因枪的共转化是将含有不同目的基因的表达载体混合在一起, 通过基因枪轰击同一受体而进行的遗传转化[ 13] . 根癌农杆菌介导的遗传转化主要与农杆菌细胞内的 T i 质粒有关.
 
在 T i 质粒上, 有两个区域与 T i 质粒介导的基因转化有密切关系, 即 T -DNA ( transferred DNA) 和 Vir 区( virulence reg ion) . T -DNA 即转移 DNA,
 
是整合到植物染色体的农杆菌质粒 DN A 片段. T - DNA 基因并不与 T -DNA 的转移及整合有关, 这一过程是由 Vir 区基因执行的. Vir 区基因的表达产物对 T -DNA 进行加工和组装形成复合物, 完成 T - DNA 的转移[ 4] . 农杆枪法即利用V ir D1 对T-DNA
 
进行剪切, 产生 T -DNA 单链, 然后以类似于细菌结合转移过程的方式将 T -DNA 与 VirD2 组成的复合物转入植物细胞, 转入细胞核的 T -DN A 复合物就能以低拷贝整合入植物染色体中. 他们通过基因枪法将 3 种质粒转入烟草细胞, 其中 2 种质粒分别含有 VirD 1 和 Vir D2 基因, 均在 CaM V35S 启动子调控之下, 第 3 种质粒包含 T -DNA 左右边界、目的基因以及N PT Ⅱ选择标记基因. 对筛选到的卡那霉素抗性植株进行 T -DNA 和植物 DNA 结合的部分序列测定结果表明, 大部分植株中 T -DN A 边界序列被正确切割, 并且 T -DNA 为低拷贝数, 其转化频率在总的转化事件中约占 20% 左右. 1997 年, Hansen
 
[ 14] 用这一方法转化玉米原生质, 同样取得了成功, 并且表明另外再导入 VirE 2 基因, 可进一步提高典型T -DNA 整合的频率.
1. 2 基因枪轰击/ 农杆菌感染法
 
根癌农杆菌介导的遗传转化首先需要损伤的植物细胞产生酚类物质作为农杆菌侵染信号, 从而激活农杆菌 Ti 质粒上 Vir 区基因的表达, Vir 区基因的产物作用于 T -DNA 的加工及 T -DNA 的转移,从而实现基因的转移. 根据这一原理, 采用基因枪微弹轰击对植物靶组织造成一定的创伤, 然后借以农杆菌感染, 有望提高转化效率[ 15] .
 
在基因枪对受体细胞造成创伤的过程中主要采用两种方式: 金粉( 钨粉) 未包裹质粒和包裹质粒轰击细胞. 1992 年, Bindey 等[ 15] **采用**种方法, 以烟草叶片和向日葵顶端分生组织为实验材料,采用未包裹质粒的钨粉进行轰击, 然后利用农杆菌进行感染, 结果表明在向日葵的顶端分生组织中可以大幅度提高 GUS 表达水平. 同时, 和标准的基因枪轰击程序相比, 在烟草中筛选到的卡那抗性克隆**少要多 100 倍. **后两种受体均获得了转基因植株. 随后 Knittel 等[ 16] 、Scorza 等[ 17] 、Zuker 等[ 18] 、 Bouamama 等[ 19] 、Lucas 等[ 20] 、明小天等[ 21] 采用这一方法转化不同的植株均获得了成功, 并获得了转基因植株, 转化效率均有提高. 但是 M esa 等[ 22] 采用此方法轰击草莓并未提高转化率. 他认为, 标准农杆菌介导的转化采用乙酰丁香酮和低的 pH 来激活 Vir 区基因的表达, 这些因素足以引发农杆菌侵染 植物, 因而采用基因枪创伤并未提高转化率. 国内赵
 

燕等[ 23] 采用后一种方式, 即带有质粒的金粉轰击水稻细胞, 然后再用带有同样基因的农杆菌感染, 通过 GUS 检测表明转化效率得到了提高. 她认为, 由于采用带有质粒的微弹轰击受体, 既能转化一定的细胞, 同时又造成受体细胞的机械损伤, 而受伤的植物细胞能分泌一种可溶性酚类化合物, 此化合物可作为农杆菌感染的诱导信号, 激活农杆菌侵染, 从而提高转化效率.
1. 3 金粉或钨粉包裹菌体细胞作为微弹轰击法
 
**早采用这一方法的是 Rasm ussen 等[ 24] , 他们以钨粉分别包裹大肠杆菌和根癌农杆菌, 轰击烟草细胞, 每枪获得了数百个瞬间表达, 但并未获得稳定表达. 同时采用钨粉包裹大肠杆菌轰击玉米细胞, **终得到了稳定转化的克隆, 但稳定表达数很低. Ras-mussen 认为, 采用该方法, 在微弹制备过程中目的基因不会被降解, 因而对于转移大分子量的 DNA 分子( > 100 kb) 是非常有效的. 同时采用该方法不需要提取质粒 DNA, 所以转化时间相对会更快. 随后, Mesa 等[ 22] 采用金粉包裹农杆菌细胞轰击草莓.**终获得了转化植株. 与标准的农杆菌介导法及基因枪轰击法相比, GUS 的表达率、卡那抗性克隆数及**终的转化率均显著提高. 国内也有实验室开展了这方面的工作, 北京大学的明小天等[ 21] 采用金粉包裹根癌农杆菌细胞轰击水稻细胞的实验表明该法可显著提高转化效率. Southern 杂交表明转基因植株含有单拷贝的外源基因插入. 他认为, 提高农杆菌与受体的共培养时间, 可以提高转化效率. 但常规的转化在感染阶段由于植株材料浸泡在菌液中, 共培养时间过长容易造成受体的污染, 通过基因枪轰击使少数细菌与植物体接触, 可以延长共培养时间, 而不会造成材料的污染, 因而可以提高转化效率.
 
2 转化受体
 
用于农杆菌和基因枪结合法转化的受体材料十分广泛. 理论上, 可以用做基因枪转化的受体材料都可以作为结合法的转化受体. 因而与农杆菌介导法相比, 扩大了受体范围. 就目前的研究来看, 所采用的受体主要集中在顶端分生组织、胚性愈伤、胚状体、悬浮细胞、幼胚和成熟胚. 表 1 列举了利用农杆菌和基因枪结合转化不同受体材料的部分结果.
 

以顶端分生组织为受体进行转化, 便于植株的再生, 因而转化周期短, 对于一些体细胞再生困难的植物, 这是一条非常有效的途径. 但缺点是产生的嵌合体多. 采用胚性愈伤和胚状体作为受体, 优点是分生能力强、易于接受外源基因, 而且继代扩繁量大,因而可以获得较多的转化植株. 但这种转化受体由多细胞组成, 从愈伤分化出的不定芽也常是多细胞起源, 因此, 嵌合体多, 而且随着愈伤组织继代培养的延长, 嵌合体比例增加. 采用幼胚和成熟胚作为受体, 突出优点是再生容易, 且可以大量获得, 耗时短.尤其是在禾谷类作物上, 许多科学家倾向于使用幼胚作为转化受体. 这种受体的缺点是筛选得到的转化体中嵌合体现象较为严重, 筛选工作量大. 以上几种转化受体可以通过逐级加压筛选的方法, 逐步淘汰非转化体, **后得到纯的转化体.
 
悬浮细胞属于单细胞受体, 由它获得的转化体嵌合体现象少, 易于筛选. 但这种受体的获得和再生困难. 目前采用的不是十分广泛.
 
3 抗性植株的筛选及外源基因的整合和遗传
 
在植物现有的转化体系下, 转基因植株的嵌合体问题是普遍存在的, 但是在转化材料的筛选过程中通过高的筛选压和多次筛选就可以尽量减少嵌合体. Zuker 等[ 18] 在对康乃馨转化体筛选过程中采用了两次筛选法, 即**次采用高的筛选压, 以消除大部分未转化的植株, 第二次适当降低筛选压来筛选再生芽, 以消除嵌合体, 通过 GUS 检测表明得到的植株均未出现嵌合体.
 
农杆菌和基因枪结合法获得的转基因植株, 通过 PCR、Southern 杂交分析结果表明, 外源基因以单一位点插入的较多, 且拷贝数较低, 与标准的农杆菌介导转化的结果相似[ 8] . 在目前的转化中, 大多数采用的都是选择标记基因, 然后通过组织化学分析,酶活性测定, 以及抗性分析证明外源基因在转化植株中的表达. 但也有少数转化植株表现出基因沉默现象, 这可能是由于基因的多拷贝造成的, 而多拷贝往往导致基因的不表达. 同时对转基因后代植株采用抗性分析证明大部分符合孟德尔遗传, 即后代分 离比例为 3∶1.也有少数不符合, 这可能是由于整
 

合的外源DNA 易发生结构变化和修饰, 如 DNA 片 丰富[ 2] .  有关这方面的问题有待于更多实验加以验
段分离、丢失、甲基化等, 致使整合的外源 DNA 遗 证.      
传特性较为复杂, 因而转基因植株后代表型也比较        
    表 1  通过农杆菌和基因枪结合法转化的植株    
  T able 1  Statistic o f tr ansg enic plants of co mbina tio n o f A g robacterium-mediated
    tr ansfor matio n and part icle bo mbar dment      
             
方法 植物 受体 外源基因 结果 参考文献
M eth od Plant Receptor For eign gen e Res ult References
             
  烟草 悬浮细胞 uid A, N PT II 转基因植株 Han sen , 等, 1996
农杆枪法 T obacco S uspension cell V ir D 1, Vir D2
     
Agrolistic 玉米 原生质体 N PT II V ir E2 转基因植株 Han sen , 等, 1997
  M aiz e Protoplasts V ir D 1, Vir D2
       
             
  烟草 叶片 uid A, N PT Ⅱ 转基因植株 Bidney, 等, 1992
  T obacco L eaves
         
  向日葵 茎尖分生组织 uid A, N PT Ⅱ 转基因植株 Bidney, 等, 1992
  S unflow er Ap ical m eris tems
         
  向日葵 茎尖分生组织 uid A, N PT Ⅱ 转基因植株 Knittel, 等, 1994
  S unflow er Ap ical m eris tems
         
  葡萄 体胚 uid A, N PT Ⅱ 转基因植株 Scor za, 等, 1995
  Grape S omatic embryos
         
基因枪轰击/ 农杆菌 康乃馨 茎切断 uid A , N PT Ⅱ 转基因植株 Zu ker, 等, 1999
Carnation S tem ex plant
感染        
           
M oicroprojectile   体胚, 胚性愈伤        
bomb ardm ent before 葡萄 uid A , N PT Ⅱ 转基因植株 Bouamama, 等, 2000
A g robacter ium S omatic embryos , Embr yo-
Grape
infection genic callus        
         
  向日葵 幼胚 uid A, N PT Ⅱ 转基因植株 Lucas , 等, 2000
  S unflow er Imm ature embryo
         
  草莓 叶片 uid A, N PT Ⅱ 转基因植株 M esa, 等, 2000
  S traw berry L eaf ex plant
         
  水稻 愈伤组织 uid A, H PT 转基因植株 明小天, 等, 2001
  Rice C allus
         
  水稻 胚性愈伤 uid A , NP T Ⅱ 瞬间表达 赵 燕, 等, 2001
  Rice E mbryogen ic callu s
         
             
  烟草 悬浮细胞 uid A, N PT Ⅱ 瞬间表达 Rasm ussen, 等, 1994
  T obacco S uspension cell
         
菌体细胞作为微弹 玉米 悬浮细胞 uid A, bar 稳定表达 Rasm ussen, 等, 1994
   
轰击 M aiz e S uspension cell
       
Bacterial cell as 草莓 叶片 uid A , NP T Ⅱ 转基因植株 M esa, 等, 2000
microprojectile S traw berry L eaf ex plant
       
         
  水稻 愈伤组织 uid A , H PT 转基因植株 明小天, 等, 2001
  Rice C allus
         

 
4 问题与展望
 
目前, 农杆菌介导和基因枪轰击相结合的转化方法在一些植物的遗传转化中已经取得了成功. 但对于这一转化方法的研究相对比较少, 对于提高转化率的机理还没有明确的解释. 因此还有许多具有挑战性的问题有待进一步探索.
 
( 1) 农杆枪法的转化是以共转化为基础. 目前对共转化的作用机理研究得还不清楚, 有时也较难保证将发生共转化的目的基因都导入同一受体中, 共转化方法的转化率不稳定, 随不同的转化事件、表达
 

载体的构建方式和数量、受体等而变化较大[ 25, 26] .
 
( 2) 农杆菌的侵染能力对不同的植物有很大的差异, 目前该研究涉及到的植物种类有限, 针对某一特定的植物及组织类型还需要做特定的研究. 同时 T i 质粒中V ir 区和 T -DNA 基因转移的关系需要进
一步研究[ 8, 27~2 9] .
 
( 3) 在基因枪对受体造成创伤的过程中, 准确把握受体的损伤程度和金粉( 钨粉) 大小及轰击参数的关系, 同时结合解剖学, 了解受体的组织结构, 对提高农杆菌的感染效率**关重要.
 
( 4) 基因枪轰击/ 农杆菌感染法, 由于基因枪操作方便, 其操作的压力, 扩散距离都能调节, 可控度高, 同时对受体材料造成的创伤均一, 因此为农杆菌介导打下了较好的基础[ 23] . 但由于受体材料受到两次不同程度的损伤, 外植体的再生受到一定的限制.我们以棉花的茎尖分生组织为受体, 采用该方法处理后, 发现茎尖很难生长. 因此探索出一条适合植株再生的途径尤其重要.
 
( 5) 目前, 对于金粉或钨粉包裹菌体细胞作为微弹轰击法能否提高转化效率, 报道不一. 同时, 对于这种方法的转化机理还没有一个明确的解释. 但是,采用该方法对 DNA 的损伤程度要小于金粉或钨粉包裹质粒, 因此对于转移大片段 DNA 应是十分有效的方法. 有关这方面的问题需要进一步的研究和探索.
 
 


然而可以肯定的是, 两种方法相结合的转化体系是以农杆菌介导的遗传转化为基础, 所以, 外源基因在植物细胞中的拷贝数较低, 遗传稳定性好. 同时该方法吸收了基因枪轰击法受体类型广泛、可控性好等优点, 因而在植物遗传转化中重复性好. Bindey 等[ 15] , Bouamama 等[ 19] 分别对受体采用不同的创伤方式, 如解剖刀、解剖针等, 再用农杆菌感染, 转化效率均低于基因枪轰击/ 农杆菌感染的方法, 并且重复性不好.
 
总之, 随着实验方法与研究手段的不断更新和改进, 以及细胞生物学和分子生物学等理论与技术的发展, 农杆菌和基因枪结合的转化方法将会不断完善, 也必将在更多的植物基因工程育种方面发挥更大的作用.
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