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基因枪法在植物转基因中的应用


基因枪法是 1987 年由美国康奈尔大学生物化学系 Sanford 提 [1] , 是指用钨粉或金粉包裹外源 DNA,而后依靠基因枪装置,利用高压氦气冲击波加速微弹去穿透植物细胞壁和细胞膜, 使外源 DNA 进入植物细胞并整合到植物细胞染色体组中,从而达到稳定遗传和表达的目的。该方法对受体材料、耙细胞来源基本不受限制,细胞、组织、器官等均可作为受体用以转化。目前通过基因枪技术,很多植物都可以得到转化,如小麦[2]、水稻[3]、玉米[4]、大豆[5]、棉花[6]等。
一、基因枪法将 GmDR EB 基因导入大豆
 
基因枪法遗传转化多用于对农杆菌不敏感的物种和基因型。 McCabe 等[7]用外源 DNA 包被的钨粒对大豆茎尖分生组织进行轰击,获得大豆转基因植株,此后,这一技术便很快在大豆中得到了应用,成为大豆转化的主要方法之一。其中,体细胞胚团块因为可以长期继代增殖,具有两极性等优点,是基因枪理想的靶组织。1999 年,Maughan 等[8]**用基因枪轰击在悬浮条件下继代培养后转入固体培养基的体细胞胚,将牛酪蛋白基因转入大豆,获得了可育转基因植株。在建立了固体继代增殖大豆体细胞胚的基础上[9],用基因枪法对大豆体细胞胚进行 PSY 基因转化的研究[10]。以下以大豆体细胞胚为受体,利用基因枪法将抗逆相关基因 Gm2DR EB 导入大豆体细胞胚中, 获得了抗性植株,为运用分子育种方法培育大豆抗逆新品种奠定了理论基础。
 
材料与方法
 
1.受体与供体材料 受体为大豆基因型九 9313、九 9568 和黑农
 
41 的体细胞胚,供试质粒 pRdGM- bar,由中国农科院作物栽培育种所马有志博士惠赠。质粒大小为 6875bp,含有目的基因 GmDR EB(编码 DREB 转录因子)、植物抗性筛选标记磷化乙酰转移酶基因 bar。
 
2. 大豆体细胞胚对 PPT 的基础抗性 在大豆体细胞胚继代培养基中分别加入 0、3、5、7、9、11mg/L 的 PPT,继代培养一个月后调查体细胞胚的褐化率,以确定大豆体细胞胚转化后**适的 PPT 筛选浓度。
3. 基因枪轰击大豆体细胞胚  在基因枪轰击大豆体细胞胚前用
 
014mol/L 甘露醇预处理 4h, 轰击过程按 Bio- Rad PDS1000/He 基因枪使用说明书进行,气压为 1100p si,轰击距离 6cm,每皿轰击一枪。
 
4. 抗性体细胞胚筛选及植株再生 大豆体细胞胚经基因枪轰击后在继代培养基上恢复培养 1 周,转到 2~3mg/L PPT 筛选培养基上连续筛选 4 次,每次 15~20d,然后转移**萌发培养基继续筛选,3~4 周后长成抗性小植株。
 
5. 抗性植株的分子检测 抗性植株大豆叶片 DNA 提取、PCR、 PCR- sout hern 杂交(DIG 试剂盒方法)检测参照**关林方法进行[11]。bar
基 因 引 物 序 列 (5′- AA GCACGGTCAACTTCCGTA - 3′,3′- CAAA GACCGTCGACCTGAA G- 5′)扩增长度 412bp,PCR 反应程序为 94℃变性 3min,(94℃变性 1min,54℃退火 30s,72℃延伸 30s)30 个循环,72℃延伸 10min;GmDR EB 基因引物序列 (5′-A TG GAA GAC A GG GA T
CAC TGT TGT TC- 3′,3′-TCA A TC TTG AA G CTC TTC GA G TTT 
TC - 5′)扩增长度 500bp,PCR 反应程序为 94℃变性 5min,(94℃变性 1 min,56℃退火 1 min,72℃延伸 1min)35 个循环,72℃延伸 7min 。
 
结果和分析
 
1. 大豆体细胞胚对 PPT 的基础抗性 在继代培养基中加入不同浓度的 PPT 时,大豆基因型九 9313、九 9568 和黑农 41 的体细胞胚的褐化率见图 1 。

2.1 农杆枪法 农杆枪法是 1996 年由 Han sen 和 Ch ilton 所采
 
用。并将它命名为 A gro list ic 转化法。该方法以基因枪的共转化与根癌农杆菌介导的遗传转化为理论基础。基因枪的共转化是将含有不同目的基因的表达载体混合在一起,通过基因枪轰击同一受体而进行的遗传转化。根癌农杆菌介导的遗传转化主要与农杆菌细胞内的 T i 质
 
粒有关。在 Ti 质粒上,有两个区域即 T- DNA(transferred DNA)和 V ir
(virulence region)。农杆枪法即利用 VirD1 对 T- DNA 进行剪切,产 [责任编辑:张新雷]
生 T- DNA 单链,然后以类似于细菌结合转移过程的方式将 T- DNA
 
与 V irD2 组成的复合物转入植物细胞,转入细胞核的 T- DNA 复合物就能以低拷贝整合入植物染色体中。1997 年 KHan sen 等用这一方法转化玉米原生质,取得了成功,并且表明另外再导入 VirE2 基因,可进一步提高典型 T- DNA 整合的频率。
 
2.2 基因枪轰击/农杆菌感染法  根癌农杆菌介导的遗传转化首


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