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提高小麦基因枪法转化效率的研究

小麦是我国重要的粮食作物之一。培育更多 高产、稳产、优质小麦新品种对国家粮食安全和改 善民生具有重要意义。但是,由于受各种生物及 非生物胁迫等不利因素的影响,常导致小麦大幅 度减产及品质降低。同时,在当前资源短缺、环境 恶化和市场竞争等多重压力下,也要求小麦在产 量性状、品质性状、抗逆性、抗病虫性和养分高效 小麦是我国重要的粮食作物之一。培育更多 高产、稳产、优质小麦新品种对国家粮食安全和改 善民生具有重要意义。但是,由于受各种生物及 非生物胁迫等不利因素的影响,常导致小麦大幅 度减产及品质降低。同时,在当前资源短缺、环境 恶化和市场竞争等多重压力下,也要求小麦在产 量性状、品质性状、抗逆性、抗病虫性和养分高效 利用特性等方面的遗传改良实现突破性进展。现 代分子生物学技术的迅猛发展,为解决以上遗传 改良问题提供了很好的契机。由于转基因技术可 以打破物种间的生殖隔离,通过从近缘种属和其 他物种中发掘克隆相关性状的优异基因,并对其 进行遗传转化,进而可以达到遗传改良的目的。 因此,转基因技术已成为解决小麦等主要农作物重要性状改良瓶颈问题的重要技术途径。
 
目前,大豆、棉花、玉米、油菜等转基因作物已进入商品化生产,取得了显著的经济和社会效益。小麦是人们普遍认为**难转化的重要农作物之一。1992年,Vasil等利用基因枪法获得了世界上**株转基因小麦[1],之后基因枪法成为小麦遗传转化的主导方法,目前占68.8%[2]。人们利用基因枪法相继将具有抗逆[3-4]、抗病虫[5-8]、高光效[9-11]和优质[12-13]等性状的功能基因导入小麦。在基因枪转化过程中,选择合适的转基因表达载体及受体组织,优化基因枪的轰击参数可有效提高基因枪的转化效率[14]。尽管**近几年小麦转基因研究取得了长足的进展,但小麦转化效率还是很低,多为0.1%~3%[2]。可以说目前基因枪介导的小麦转化仍处在建立和优化完善转化系统阶段。为此,本研究对基因枪轰击参数的优化、优良受体基因型的筛选和培育及载体类型的选择等方面做了较深入的研究,旨在研究出一种高效的基因枪介导的小麦遗传转化技术体系。
 
1 材料与方法
 
1.1 供试材料
 
供试 材 料 为 郑 麦 7698、郑 麦 0943、郑 麦
 
0856周麦1904H668-7-9-504H659-11-5-7和新乡 YCHX026,均由河南省农业科学院小麦研究所分子育种研究室提供。
 
1.2 种植环境2013年10月份将供试材料均分别种植于国
 
家黄淮海转基因小麦中试与产业化基地温室和大田。在温室内,冬季以燃煤火炉增加室内CO 浓
 
度和温度,在小麦孕穗期温室内CO 浓度为715
    ·     -1左右,温度 15~28 ℃ (此生育时
mol mol                    
μ                                            
期大田 CO2 浓度为 380       ·   -1左右,温度
              mol mol      
                          μ                  
9~22℃ ),并在                 以生物钠灯增
        1600-2000        
加光照,光照强度为             ·   -2。温室和大
                      600 mol      
                          μ                
田均采用常规管理。                    
1.3 载体和培养基                          
                                         
    转化所用载体有3种类型,包括双元表达载
                )、线 性 共 转 化 表 达 载 体
    pCAMBIA3301                      
        启动子::目标基因::     终止子和
Ubiquitin                           Nos  
Ubiquitin 启动子:: ::       止子)和环状共
          bar Nos            
转化表达载体(                           ),均含有
              pWMB003   pAHC20
目标基因玉米 C4     。其中,双元表达载体
                      pepc                  
除了含有目标基因之外,还携带植物筛选标记基
 
bar和细菌筛选标记基因kan 等骨架序列,由
 
河南省农业科学院小麦研究所分子育种研究室提
供;环状共转化表达载体中,WMB003载体包含

 
目标基因和细菌筛选标记基因bla,但不含bar
因,AHC20载体包含bar基因和bla 基因,均由

 
中国农业科学院作物科学研究所提供;线性共转化表达载体中,每个载体均是从环状表达载体上酶切回收,只包括启动子、目标基因和终止子在内的**小表达框,不含任何选择标记基因,均由河南省农业科学院小麦研究所分子育种研究室提供。
诱导培养基:MS 基本培养基+2m·L-1
4-D+0.4%琼脂+3%蔗糖H6.2

高渗培养基:MS基本培养基+2m·L-1
 
          琼脂       · -1 甘露醇
24-D+0.7%     +0.4mol L    
3% 蔗糖,                  
      pH5.8                    
    分化培 养 基:/     基 本 培 养 基 +0.5
              12MS      
·   -1           · -1       琼脂
mg NAA+2.0mg L KT+0.4%    
+3% 蔗糖,                    
    pH6.2                  
    生根培 养 基:/     基 本 培 养 基 +0.2
              12MS      
·   -1 NAA+0.4% 琼脂 +3% 蔗糖,    
mg       pH6.2
1.4   小麦材料的预处理              
                             
    月底和 月初分别从温室和大田采集扬
                             
花后 12~14d 的郑麦   、郑麦   、郑麦
            7698   0943    
    、周麦   、                  
0856     1904H668-7-9-504H659-11-
5-7和新乡 YCHX026的麦穗,取穗中部、大小一致的未成熟种子,用70% 的酒精表面消毒1min无菌水冲洗3次后用0.1%的 HgCl2 消毒
10min,无菌水冲洗3~4次。无菌条件下剥出幼胚(1mm 左右),于含有2m·L-1 2,4-D 的MS诱导培养基上暗培养4~5d后开始转化。
 
1.5 基因枪转化
 
将暗培养后的愈伤组织置于高渗培养基上(6cm 培养皿中央2.5cm 直径范围内)渗透处理4~6h后进行基因枪轰击。在基因枪轰击参数优化研究中,共设置4项参数,金粉用量:每枪50
μ250μg和450μ靶距6cm9cm 和12cm
轰击压力900psi1100psi和1350psi轰击次
数:1次和2次。其中,在研究某一参数时,其他
参数均采用常用参数(金粉用量:每枪250μ;靶
距:6cm;轰击压力:900si;轰击次数:1次)。而
 
在本试验其他研究中,基因枪轰击所用参数均采用2.1中所得**优基因枪轰击参数(金粉用量:每
枪250μ轰击距离9cm轰击压力1100psi
轰击次数:1次)。

先受体材料必须生长健壮,且应避免病虫害侵染及不适宜的温度、湿度等,否则会影响供体组织的生理状况和转化时的细胞全能性[2]。本研究比较了小麦供体材料在温室和大田的生长状况及转化效果,将小麦供体种植于温室,通过增加室内CO浓度和温度,使小麦受体生长健壮,可以增强外植体的再生能力,从而提高转化效率。
 
选择合适的表达载体,对外源基因的转化、表
 
达和转基因植物食用安全性都是非常重要的。本
 
研究结果表明线性表达载体的转化效率高于双元表达载体和环状表达载体,其主要原因可能是由于线性表达载体是目的基因的**小表达框,不包含任何载体骨架序列,易整合到小麦基因组中,比
 
较适合基因枪法转化小麦。另外线性表达载体和环状表达载体采用玉米Ubiuitin 启动子比双元表达载体采用的花椰菜CaMV35S启动子更能够有效促进外源基因的长期稳定高效表达。线性表达载体的稳定表达在国内外已有成功的报道,Fu等[18]**早将含有bar基因的无载体骨架序列基因直接转化水稻幼胚获得成功;姚 琴等[19]用**小表达框进行基因枪共转化小麦获得成功。Uze等[20]和 Wriht等[21]分别用线型 DNA 和 mi
 
筛选标记来提高小麦的基因枪转化效率,并取得很好效果。本研究将玉米C 型**小表达框和bar基因**小表达框共转化小麦幼胚,且这两个基因均是在Ubiuitin 强启动子下表达,该启动子具有高强度的表达能力,在单子叶植物叶片中有高水平的转录体。获得转化的线性玉米 C能够插入到小麦的基因组中,并能够快速的获得无筛选标记基因的转基因植株。双元表达载体上携带有植物筛选标记基因表达框(如bar基因、基因等)和细菌筛选标记基因表达框(如bla基因、kan基因等)等骨架序列,转化过程完成后这些元件在植物中的存在就变的多余,给
 
环境和食用安全性带来了隐患。环状表达载体上虽不含植物筛选标记基因,但含细菌筛选标记基因,也不利于转基因植物的食用安全性。线性表达载体是只包括启动子、目标基因和终止子在内的**小表达框,不含任何选择标记基因,大大提高了转基因小麦的环境和食用安全性。
 
由于小麦组织培养比较困难,转基因方法在小麦中还没有取得长足的进步。小麦基因型在很大程度上影响着小麦愈伤组织的组培特性。发掘具有优秀组培特性的小麦基因型,对小麦转基因育种非常重要。目前小麦遗传转化选用的受体材料主要还是以其组培特性作为选择标准,比如选用Bobwhite等再生能力强,转化效果好的基因型作为受体,这些基因型农艺性状较差,很难在生产上推广应用。因此,应该从生产上大面积推广的品种或综合性状优良的高代品系中筛选转化效果好的基因型作为受体材料,以快速实现转基因小麦的产业化。本研究从大面积推广品种中筛选出了周麦19、郑麦7698和郑麦0943等再生能力强和转化效果好的受体品种,并获得了一批无筛选标记的转基因小麦,为小麦的遗传改良研究提供重要的材料支撑。
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