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超声波萃取-高效液相色谱测定咖啡粉和速溶咖啡中的葫芦巴碱

葫芦巴碱( 3-碳酸-N-甲基吡啶) ( 结构见图 1)
是咖啡焙烤过程中形成风味成分的主要化学物质之
[1]       [2,3]
。现代药理学表明葫芦巴碱具有降血糖  
  [4,5] 。咖啡中葫芦巴碱的含量与咖啡
抗肿瘤等作用    
      [6 - 8] 。因此葫芦巴
品种、生长环境和加工工艺有关  
碱含量可作为鉴定咖啡质量或者咖啡加工过程的有
效手段之一。    
  葫芦巴碱含量的测定方法有薄层色谱( TLC ) 、
   
高效液相色谱 ( HPLC ) 、液相色谱-质谱 ( HPLC-
 
MS) [9,10] 、亲水作用色谱( HILIC) [11,12] 、毛细管电泳
         


随着国际咖啡企业对云南小粒咖啡品种的认可并收购其原材料,云南省也投入巨资大力发展咖啡产业,但尚欠缺科学系统的质量控制与综合评价体
 
系。本文建立了简单、快速测定咖啡中葫芦巴碱的地方标准,对云南省咖啡豆原料及其制品的质量控
 
制、资源合理开发利用具有重要的指导意义。
 
1 实验部分
 
1. 1  仪器及试剂
 
Alliance 2695 型高效液相色谱仪 ( Waters 公
 
司) ,配四元泵溶剂淋洗系统、自动进样系统、2487
 
紫外检测器; HB50 型超声波萃取仪( 功率 50 W,频
 
率 40 kHz,容量 2 L,南京莱步科学器材公司 ) ;
 
HS20500D 型超声波萃取仪 ( 可选三档,**大功率
 
500 W,频率 40 kHz,容量 20 L,天津恒奥科研有限
 
公司) ; Arium 611DI 型纯水器( Sartorius 公司) 。
 
标准品和试剂: 葫芦巴碱( 纯度 98%) ,中国生物药品检定所研制。色谱纯甲醇( Fisher 公司) ,醋
 
酸锌、亚铁氰化钾、磺基水杨酸均为分析纯( 国药集团化学试剂云南11选5开奖结果) 。
 
通过企业送检方式收集焙烤咖啡粉和速溶咖啡样品各 5 份,均为云南小粒咖啡。将样品于常温下
 
保存。
 
1. 2 色谱条件
 
色谱柱: BondPak NH2 ( 250 mm × 4. 6 mm ,5
 
μm ; Waters 公司) ; 流动相: 甲醇-水( 82∶ 18,v /v) ,
 
柱温: 30 ℃ ; 流速: 0. 8 mL /min; 检测波长: 260 nm ;
 
进样量: 10 μL。
 
1. 3 标准曲线
 
精密称取葫芦巴碱标准品 10 mg,置于 10 mL
 
容量瓶中,用水溶解并稀释**刻度,摇匀,得葫芦巴碱贮备液 1 000 mg /L。用水将其分别稀释为 1、4、
 
10、20、40 mg /L 系列质量浓度的标准溶液。分别取
10 μL 进样测定,以葫芦巴碱的峰面积对其质量浓
 
度作标准曲线。
 
1. 4 超声萃取样品前处理
 
精密称取 0. 5 g 咖啡样品,置于 250 mL 锥形瓶中,加入 80 mL 水,室温下超声萃取 5 min,滤纸过滤,加入 1 mL 5% 磺基水杨酸溶液于滤液中,摇匀,转移定容于 100 mL 容量瓶中,经 0. 45 μm 滤膜过滤,滤液供 HPLC 分析。
 
1. 5 热浸提样品前处理
 
参照文献[6,8,15]的方法,精密称取 0. 5 g 样
 
品,置于 250 mL 锥形瓶中,加入 80 mL 热水 ( 沸
 
腾) ,于 80 ℃ 水浴中萃取 2 h,过滤,冷却后加入 1 mL 5% 的磺基水杨酸于滤液中,摇匀,转移定容于
100 mL 容量瓶中,经 0. 45 μm 滤膜过滤,滤液供
 
HPLC 分析。
 
2 结果与讨论
 
2. 1  超声萃取时间的优化
 
试验在 HB50 超声波萃取仪的功率( 50 W) 和
 
频率( 40 kHz) 固定条件下,比较不同的超声萃取时间( 0 ~ 30 min) 时葫芦巴碱的提取率,每个试验重复 3 次。由于葫芦巴碱的水溶性好,超声萃取前
 
76% 的葫芦巴碱能溶解于水。萃取时间在 5 ~ 30 min 内,葫芦巴碱萃取率的变化值小于 1%,因此 5 min 能完全萃取葫芦巴碱。
 
2. 2 超声波功率对萃取葫芦巴碱的影响
 
在 HS20500D 超声波萃取仪的频率设定为 40 kHz,功率分别设定为 125、250 和 500 W 条件下,分
 
别对咖啡样品进行 30 s、1 min、2 min 和 3 min 的萃
 
取。在 125 W 下萃取 3 min,葫芦巴碱的萃取率可
 
达 97%; 在 500 W 下萃取 1 min,葫芦巴碱萃取率可
 
达 98%。结果表明,超声波功率大,短时间内萃取效
 
率高。本实验选择在 HS20500D 超声波萃取仪**大功率( 500 W) 下进行萃取。
 
2. 3 蛋白质沉淀剂的选择
 
由于速溶咖啡中蛋白质较多,萃取液混浊,经滤纸过滤后直接用 0. 45 μm 的滤膜很难过滤,需净化
 
处理。比较了 5% 磺基水杨酸和 10% 醋酸锌 + 10%
 
亚铁氰化钾混合溶液对咖啡中蛋白质的沉淀作用。通过加标试验可知,在经滤纸过滤后的萃取液中加
 
入 1 mL 10% 醋酸锌 + 1 mL 10% 亚铁氰化钾沉淀剂,葫芦巴碱的回收率为 0; 加入 1 mL 5% 磺基水杨酸沉淀剂,葫芦巴碱的回收率为 94%。进一步试验表明,在咖啡粉的萃取液中加入磺基水杨酸沉淀剂,

第 11 期 刘宏程,等: 超声波萃取-高效液相色谱测定咖啡粉和速溶咖啡中的葫芦巴碱 ·1105·

 
由于产生共沉淀,葫芦巴碱的回收率为 0,推测是由于磺基水杨酸在沉淀蛋白质过程中,包裹了水不溶性颗粒,形成了带电大分子胶体,吸附了葫芦巴碱;
当咖啡萃取液过滤后再加入磺基水杨酸,消除了咖啡萃取液中的不溶性颗粒,降低了形成大分子胶体的几率,葫芦巴碱的回收率可达到 97%。本实验选择在过滤后的萃取液中加入 1 mL 5% 磺基水杨酸
 
来除去样品中的蛋白质。
 
2. 4 色谱条件的优化
 
葫芦巴碱为极性的水溶性酸,在反相 C18 柱上有弱的保留。为了提高葫芦巴碱在反相 C18 柱上
 
[6,8,15] 或者
的保留,需要在流动相中添加酸、缓冲盐
离子对试剂,但这导致色谱柱的平衡时间较长,保留时间的重现性差。葫芦巴碱分子中有游离的氢,能
 
与 NH2 填料形成强的分子间作用力,使得葫芦巴碱在 NH2 柱上比在反相 C18 柱上的柱效高,故本实验选择以 NH2 柱作为分离柱。
 
流动相为甲醇-水( 10∶ 90,v /v) 时,葫芦巴碱在
 
NH2 柱上的保留相对较弱,保留时间为 3. 271 min,
 
样品中的杂质峰干扰其测定; 增加流动相中有机相的比例能延长葫芦巴碱在 NH2 柱上的保留时间,当
甲醇-水的比例为 82 ∶ 18 ( v /v ) 时,葫芦巴碱和样品中的杂质有好的分离度,其保留时间为 7. 068 min
 
( 见图 2) 。
比较了超声波萃取和热浸提萃取方法测定葫芦巴碱含量的差异。每个样品均重复测定 3 次,计算平均值,两种萃取方法的测定结果呈线性关系,其方程 Y = 0. 989X,其中 Y 为采用超声波萃取测得的葫芦巴碱含量,X 为采用热浸提萃取测得的葫芦巴碱含量,相关系数为 0. 996 4,表明超声波萃取效率与经典的热浸提效率相当。
 
2. 6 标准曲线、日内稳定性、检出限及定量限
 
对 1 ~ 40 mg /L 质量浓度范围的 5 个标准溶液分别进行测定,结果表明葫芦巴碱的质量浓度 Y
 
( mg /L) 与其峰面积 X 呈线性关系,线性方程为 Y
3 3 , 2
= 2. 12 × 10 X - 3. 10 × 10 相关系数 r 为0. 999 8。
 
对同一份咖啡样品萃取液每隔 1 h 进样 1 次测
 
定,8 h 内峰面积的相对标准偏差( RSD ) 为 3. 02%,
 
表明萃取液在 8 h 内稳定。
 
根据信噪比 ( S /N )  = 3 确定方法的检出限
 
( LOD) 为 0. 2 mg /L,以 S /N = 10 确定方法的定量
 
限( LOQ) 为 1. 0 mg /L。
 
2. 7 精密度试验
 
2. 7. 1 日内测定的重复性试验
 
由相同人员使用相同的仪器,在日内测定 2 份
 
咖啡粉( Coffee pow der-1 和 Coffee pow der-2) 和 2
 
份速溶咖啡( Instant coffee-1 和 Instant coffee-2) ,
 
每个样品重复测定 5 次。结果表明,在相同条件下,日内重复测定葫芦巴碱含量的 RSD 均小于 3% ( 见
 
表 1) 。
 
表 1 日内测定葫芦巴碱的重复性结果( n = 5)
 
Table 1 Repeatability of trigonelline content determined in intraday test ( n = 5)
 
Sample Content / ( g /kg) RSD /%
       
Coffee pow der-1 2 . 44 1. 72
Coffee pow der-2 3 . 89 0. 77
Instant coffee-1 0 . 506 2. 54
Instant coffee-2 0 . 304 2. 34
       
 
2. 7. 2 日间测定的重复性试验
 
由相同人员使用相同的仪器,在一个月的第 10
 
天、第 20 天和第 30 天分别对 2 份咖啡粉 ( Coffee pow der-1 和 Coffee pow der-2) 和速溶咖啡( Instant coffee-1 和 Instant coffee-2) 进行测定,每个样品重复测定 5 次。从结果( 见表 2) 可以看出,日间重复测定葫芦巴碱含量的 RSD≤7%。
 
2. 7. 3 人员比对重复性试验
 
由两个试验人员使用相同的仪器设备,在**内对相同的咖啡粉 ( Coffee pow der-1 和 Coffee pow der-2) 和速溶咖啡( Instant coffee-1 和 Instant coffee-2) 进行测定,每个样品重复测定 5 次。结果
 
( 见表 3) 表明不同人员重复测定葫芦巴碱含量的相对偏差( RD) ≤0. 012%。

·1106· 色 谱 第 29 卷

 
 
  表 2     日间测定葫芦巴碱含量的重复性        
  Table 2 Repeatability of trigonelline content      
        determined in interday test          
                   
        Content   RSD Mean content RSD  
Sample Test time n = 5) / ( n = 5) / ( n = 3) / ( n = 3) /
      (
  in month g /kg)     % ( g /kg)     %  
        (          
Coffee 10th day 2 . 44   1 . 72 2 . 38   2 . 17  
pow der-1 20th day 2 . 33   1 . 93            
  30th day 2 . 37   3 . 36            
Coffee 10th day 3 . 89   0 . 621 3 . 76   3 . 15  
pow der-2 20th day 3 . 73   1 . 25            
  30th day 3 . 66   2 . 12            
Instant 10th day 0 . 506   2 . 55 0 . 47   6 . 96  
coffee-1 20th day 0 . 465   6 . 97            
  30th day 0 . 441   2 . 49            
Instant 10th day 0 . 304   2 . 32 0 . 29   3 . 88  
coffee-2 20th day 0 . 291   3 . 39            
  30th day 0 . 281   3 . 22            
           
  表 3 不同人员测定葫芦巴碱含量的重复性      
  Table 3   Repeatability of trigonelline contents      
        determined by two analysts          
                   
        Content   RSD Mean content RD  
Sample Analyst ( n = 5) / ( n = 5) / ( n = 2) / ( n = 2) /
        ( g /kg)     % ( g /kg)     %  
                               
Coffee 1       2 . 33   1 . 93 2 . 36   0 . 07  
pow der-1 2       2 . 40   2 . 79            
Coffee 1       3 . 73   1 . 25 3 . 78   0 . 11  
pow der-2 2       3 . 84   2 . 52            
Instant 1       0 . 440   2 . 44 0 . 446   0 . 011  
coffee-1 2       0 . 451   4 . 64            
Instant 1       0 . 290   3 . 39 0 . 297   0 . 012  
coffee-2 2       0 . 302   5 . 33            
       
RSD: relative standard deviation; RD: relative deviation.    

2. 8  回收率试验
在已知葫芦巴碱含量的咖啡粉( 或速溶咖啡)
中分别加入 1. 0、2. 0、4. 0 g /kg ( 或 0. 2、0. 4、0. 8
 
g /kg) 3 个含量水平的葫芦巴碱,每个添加水平样
 
品重复测定 5 次,计算回收率。从结果( 见表 4) 可
 
知,所有样品中葫芦巴碱的加标回收率大于 90% 以
 
上,RSD≤3. 01%。

表 4  咖啡样品中葫芦巴碱的加标回收率( n = 5)
 
Table 4 Recovery of trigonelline spiked in coffee samples ( n = 5)
 
Sample Background / Spiked / Recovery / RSD /
( g /kg) ( g /kg) % %
 
         
Coffee pow der 2. 35 1. 0 92. 5 3. 01
    2. 0 97. 5 2. 17
    4. 0 93. 3 1. 51
Instant coffee 0. 287 0. 2 98. 3 2. 25
    0. 4 95. 2 1. 84
    0. 8 97. 5 2. 61
         


2. 9 咖啡粉和速溶咖啡样品的测定经测定,云南焙烤咖啡中葫芦巴碱的含量范围
 
为 2. 35 ~ 4. 21 g /kg,是巴西焙炒咖啡中葫芦巴碱含
 
[8] 的 1 /2,说明云南省咖啡加工工艺导致葫芦巴
碱的损失大; 速溶咖啡中葫芦巴碱的含量范围为
 
0. 287 ~ 0. 524 g /kg,比焙烤咖啡中葫芦巴碱的含量低一个数量级。因此,要品尝咖啡特殊的香气、口
 
感,**好饮用焙烤咖啡。
 
3 结语
 
采用超声波萃取咖啡中的葫芦巴碱能缩短分析时间,提高分析效率; 用 NH2 柱分离葫芦巴碱可以弥补反相 C18 柱对葫芦巴碱吸附弱、柱效低等弱点。准确度和精密度试验结果表明该方法准确可靠,可以用于例行和大量样品的分析检测工作。
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