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食品微生物检验中两种均质方法的比较

食品微生物检验过程中,样品的均质是十 分重要的步骤,直接关系到检验的准确性和检出 率。现有食品微生物检验标准规定的均质方法为 两种[1]:一种为将一定量的供试品和稀释液加入 无菌均质杯中,以一定的转速均质一定时间,制 成样品匀液,即“旋刀式均质”;另一种为将一 定量的供试品和稀释液加入均质袋中,用拍击式 均质器拍打一定的时间,制成样品匀液,即“拍 击式均质”。脉冲式均质是近年出现的均质方 法,一些人员进行了使用方面的研究[2-3],现有 食品微生物检验标准没有规定使用该均质方法。 食品品种不同,质地也千差万别,在日常检验 中,我们要合理选择均质仪器,尽量减少食品中 微生物的变化,提高检验的准确度。 为考察两种均质方法对食品微生物检验准 确性的影响,我们选取菌落总数、金黄色葡萄球 菌和霉菌计数3个检验项目作为代表,分别进行 回收率和检出率对比试验。1 仪器与材料
 
1.1 仪器
 
JYD-400型拍击式均质器(上海五相仪器仪表公司);JT-C型旋刀式均质器(漯河市金田试验设备研究所)。
1.2 菌种
 
大肠埃希菌Escherichia coli [CMCC(B)44 1 0 2 ] ,金黄色葡萄球菌S t a p h y l o c o c c u s
 
aureus [CMCC(B)26 003],黑曲霉Aspergillus niger[CMCC(F)98 003]均由中国食品药品检定研究院提供,均为第3代。
 
1.3 培养基
 
平板计数琼脂培养基(青岛高科园海博公司,批号:20140902);孟加拉红培养基(北京奥博,批号:20140528);7.5 %氯化钠肉汤(青岛高科园海博公司, 批号:20140801);Baird-Parker琼脂平板(青岛高科园海博公司,批号:20130716)。以上培养基均为脱水培养基,按说明书配制并灭菌后使用。
 
1.4 样品信息
 
选取有代表性的样品27批,信息见表1。
 
  1 样品信息表  
       
样品 样品名称 样品形态 批号
编号
     
       
1 荆条蜂蜜 黏稠液体 20140801
2 洋槐蜂蜜 黏稠液体 20140806
3 枸杞蜜 黏稠液体 20140803
4 高钙奶粉 细粉末 14170052
5 高钙高铁奶粉 细粉末 20140618QK107
6 学生高钙奶粉 细粉末 20140617QK101
7 鸡精 疏松粗颗粒 20140905
8 鸡精 疏松粗颗粒 20141016
9 鸡精 疏松粗颗粒 20141101
10 硬质糖块 坚硬固体 20140920
11 凝胶糖果 韧性固体 20141016
12 双味棒硬糖 坚硬固体 20141207
13 五仁月饼 固体含坚果 20140817
14 果仁月饼 固体含坚果 20140822
15 苏式五仁月饼 固体含坚果 20140715
16 阿胶粉 固体坚硬粉末 20140721
 

 
17 阿胶粉 固体坚硬粉末 20140720
18 阿胶粉 固体坚硬粉末 20140722
19 小肥羊风味肉串 含韧性生肉片 20140806
20 鸡肉串 含韧性生肉片 20140727
21 骨肉相连鸡肉串 含生鸡肉脆骨 20140801B
22 儿童钙奶饼干 疏松固体 20141016
23 老年饼干 疏松固体 20141009
24 数字饼干 疏松固体 20141009
25 烧牛肉 熟肉有韧性 20140817
26 烧猪心 熟肉有韧性 20140915
27 烧鸡 熟肉有韧性 20140915
       
 
2 方法与结果
 
2.1 菌液的制备
 
参考《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法[4]规定的菌液制备方法,将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌制成菌悬液,将黑曲霉菌制成孢子悬液。并将3种菌液制成每1 mL含菌数为50~100 cfu的悬液,并准确测定菌液浓度。
 
2.2 供试液的制备
 
2.2.1 用拍击式均质方法制备供试液 根据样品的形态不同,以无菌操作的方式,称取固体样品 25 g,或用无菌刻度吸管吸取液体样品25 mL,均取3份。分别置入盛有225 mL生理盐水、7.5 % 氯化钠肉汤和水的均质袋中,调整拍击式均质器的拍击频率和拍击间隙,根据样品形态不同拍击均质1~10 min,制成1:10的样品匀液,分别用于测定菌落总数、金黄色葡萄球菌和霉菌。分别用无菌刻度吸管吸取3种1:10样品匀液1 mL,沿管壁缓慢注入各盛有9 mL生理盐水、7.5 %氯化钠肉汤和水的无菌试管中,摇匀,制成1:100稀释液;同法制成1:1000稀释液。
 
2.2.2 用旋刀式均质方法制备供试液 根据样品的形态不同,以无菌操作的方式,称取固体样品 25 g,或用无菌刻度吸管吸取液体样品25 mL,均取3份。分别置入盛有225 mL生理盐水、7.5 % 氯化钠肉汤和水的匀浆杯中,旋转均质,制成1:10的样品匀液,分别用于测定菌落总数、金黄色葡萄球菌和霉菌。操作时设定旋刀式均质器转
速为8000~10 000 r/min,根据样品形态不同旋转
均质1~5 min。分别用无菌刻度吸管吸取3种1:10
样品匀液1 mL,沿管壁缓慢注于各盛有9 mL生
理盐水、7.5 %氯化钠肉汤和水的无菌试管中,
摇匀,制成1:100稀释液;同法制成1:1000稀释
液。            
2.3 检验方法          
按GB 4789.2-2010 菌落总数的测定、GB
4789.15-2010 霉菌和酵母计数和GB 4789.15-
2010金黄色葡萄球菌检验(平板计数法)3个国
家标准[1]进行检验,每种试验,每个稀释级别分
别制备3个平皿。菌落总数和霉菌计数每个平皿
接种量为1 mL,菌落数取3个平皿的平均值。金
黄色葡萄球菌每个稀释级的3个平皿接种量分别
为0.3,0.3,0.4 mL,菌落数按3个平皿菌落的和
计数。并按照每种菌的报告规则报告菌落数值。
2.4 3种菌液回收率测定
选取9类质地性质不同的样品,每种样品3
批共27批有代表性样品,分别采用旋刀式均质
方法和拍击式均质方法对样品进行均质,按2.3
项方法检验,并计算回收率:回收率=(菌液试
验组计数-供试品试验组计数-空白对照组计数)/
(已测定菌液浓度-空白对照组计数)。
2.4.1  供试品试验组 取2.2项下供试品溶液,按
2.3项方法检验。  
2.4.2  空白对照组 分别以25 mL 生理盐水、水
和7.5 %氯化钠肉汤代替样品,并按2.3项方法检
验。    
2.4.3 菌液试验组 在供试品试验组中分别加入浓
度已测定的3种菌液1 mL,并按2.3项方法检验。
3个组同时进行试验,并计算回收率,结果见
表2。    

            2 回收率试验结果            
                       
  样品   大肠埃希菌     金黄色葡萄球菌     黑曲霉    
  编号              
  旋刀式 拍击式 旋刀式 拍击式 旋刀式 拍击式
                           
    计数 回收率 计数 回收率 计数 回收率  计数 回收率 计数 回收率 计数 回收率
    /cfu /% /cfu /% /cfu /% /cfu /% /cfu /% /cfu /%  
  1 80 94 77 91 85 94 82 91 70 84 77 93  
  2 79 93 77 91 87 97 82 91 74 89 82 99  
  3 80 94 76 89 88 98 80 89 80 96 84 101  
  4 85 100 83 98 90 100 82 91          
  5 84 99 82 96 93 103 85 94          
  6 86 101 82 96 86 96 80 89          
  7 82 96 76 89 85 94 79 88          
  8 82 96 73 86 85 94 78 87          
  9 83 98 80 94 89 99 80 89          
  10 79 93 71 84 83 92 81 90          
  11 76 89 68 80 82 91 80 89          
  12 75 88 73 86 80 89 80 89          
  13         95 106 92 102          
  14         92 102 87 97          
  15         90 100 85 94          
  16 84 99 79 93 82 91 80 89 73 88 80 96  
  17 84 99 80 94 77 86 77 86 75 90 77 93  
  18 86 101 79 93 80 89 75 83 70 82 77 93  
  19         89 99 89 99          
  20         90 100 83 92          
  21         89 99 80 89          
  22 85 100 76 89 85 94 80 89 80 96 84 101  
  23 88 104 79 93 85 94 78 87 76 92 83 100  

290       食品与药品   Food and Drug 2015年第17卷第4期        
                           
24 83 98 82 96 84 93 80 89 75 90 86 104  
25 74 87 65 76 91 101 88 98 73 88 82 99  
26 79 93 66 78 93 103 85 94 72 87 82 99  
27 77 91 70 82 95 106 90 100 75 90 81 98  
                           

注:没有数据的,为食品标准不要求检验的项目。

 
3 供试品微生物检验结果对比
 
在上述27批样品中选取3个检验项目齐全的12批有代表性的食品,分别按2.2项方法制备供试液,按2.3项方法检验。两种样品处理方法检验结果见表3。
 
3 两种样品处理方法检验结果的比较
 
  菌落总数 金黄色葡萄球菌 霉菌计数
样品编号 /cfu·mL-1 /cfu·mL-1 /cfu·mL-1
   
  旋刀式 拍击式 旋刀式 拍击式 旋刀式 拍击式
             
1 40 35 <10 <10 <10 <10
2 20 20 <10 <10 <10 <10
3 30 25 <10 <10 <10 <10
16 70 65 <10 <10 15 30
17 75 75 <10 <10 15 35
18 45 40 <10 <10 25 45
22 10 <10 <10 <10 <10 <10
23 <10 <10 <10 <10 <10 <10
24 30 30 <10 <10 <10 <10
25 110 110 20 15 <10 <10
26 80 75 30 25 <10 <10
27 100 95 40 40 <10 <10
             
 
4 讨论
 
4.1 两种均质方法回收率的比较
 
由表2可见,在测定菌落总数的21批样品中,旋刀式均质方法的回收率为 87 %~104 %,拍击式均质方法的回收率为76 %~98 %;在测定金黄色葡萄球菌的27批样品中,旋刀式均质方法的回收率为 86 %~106 %,而拍击式均质方法的回收率为83 %~102 %;在测定霉菌的12批样品中,旋刀式均质方法的回收率为 82 %~96 %,拍击式均质方法的回收率为93 %~104 %;菌落总数和金黄色葡萄球菌的回收率试验中,旋刀式均
 

质方法处理的样品回收率略高于经拍击式均质方法处理的样品,霉菌回收率拍击式均质方法略高于旋刀式均质方法。
 
4.2 两种均质方法检验结果的比较
 
由表3可见,12批样品中,菌落总数、金黄色葡萄球菌两个检验项目用旋刀式均质方法得出的结果略高于拍击式均质方法的检验结果,霉菌拍击式均质方法略高于旋刀式均质方法,与回收率试验结果一致。
 
4.3 均质方法的选择
 
对于奶粉、鸡精等易于分散溶解的样品,旋刀式和拍击式两种均质方法均可选用;对于蜂蜜、阿胶粉等黏稠或不宜溶解的样品,可采取水浴锅45 ℃保温并震荡,样品分散后再使用拍击式均质方法均质2 min;对于硬糖等质地较硬或有韧性的固体样品,宜采用铜质研钵捣碎后,用旋刀式均质方法均质,切不可直接用拍击式均质方法均质,否则,会因样品较硬使均质袋破裂;生肉或熟肉制品等含有纤维较多的食品,应采用旋刀式均质方法均质,速度快且均质效果好。
 
研究结果表明,食品微生物检验过程中,要根据食品不同的质地和检验项目选择不同的均质方法,必要时对均质效果进行方法学验证,以保证食品微生物的检出效果。
 
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