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多样品组织研磨仪在提取菊科植物各组织中总RNA的应用从菊科植物组织

从菊科植物组织中提取RNA是进行菊科植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行Northern杂交分析,纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库,RT-PCR及差示分析等分子生物学研究,都需要高质量的RNA[1,2]。因此,从菊科植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在。植物RNA提取常用的方法有异硫氰酸胍法、盐酸胍法、SDS-酚法、CTAB法、酸酚法、一步法以及TR IZOL等商品化的试剂盒等[2  5],每种方法对于提取完整的RNA都有各自的优缺点。
 
有许多植物就是由于未能有效地分离纯化其组织中的RNA,而阻碍了其分子生物学方面研究的进展。其主要困难在于在这些植物组织中,或富含酚类化合物,或富含多糖,或含有某些尚无法确定的次级代谢产物,或RNase的活性较高。在完整的细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的,但当组织被研磨,细胞破碎后,这些物质就会与RNA相互作用[6]。比如,蛋白质是污染RNA样品的一个重要因素。由于RNase 和多酚氧化酶属于蛋白质,因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase 等的活性;提取缓冲液中含有蛋白质变性剂,如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等,这样在匀浆时可以使蛋白质变性,凝聚;有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质[6,7]
本文用盐酸胍法提取菊科植物中总RNA,通过多样品组织研磨仪(型号:Tissuelyser-192,净信科技,上海)处理菊科植物样品与传统研磨破碎方法处理得到的结果进行对比,说明在提取菊科植物总RNA过程中样品低温研磨的处理过程十分重要,多样品组织研磨仪是一个较好的选择,在RNA提取中避免了研磨、匀浆、超声波处理等传统方法的费力、耗时、低效等诸多缺点。
1 材料与方法
 
1.1 材料
 
菊 科植物薇甘菊(Mikaania micrantha Kunth)、豚草(Ambrosia artemisiifolia Linn)、假苍耳(Iva xanthifolia Nutt
由植物园提供。分别摘取植物根、茎、叶及花蕾,用蒸馏水冲洗后称重,0.5g/袋,液氮冷冻后-70℃贮存,备用。
1.2 实验方法
 
1.2.1 主要试剂及配制 试剂均为RNA式样专用。双蒸水加入0.05% ~ 0.1% DEPC,室温放置12h以上,高压灭菌除去DEPC,得到DEPC水。
 
抽 提缓冲液(pH=7.0 ~ 7.2):8mol/L 盐酸胍(抑制RNA酶),20mmol/L EDTA(pH=8.0),20mmol/L MES;
PCI:水饱和酚、氯仿、异戊醇25:24:1(v/v)混合;CI:氯仿、异戊醇24:1(v/v)混合;70%(v/v)乙醇、3mol/L NaCl(DEPC 水配制)。
 
1.2.1 实验样品处理 试验所用玻璃器皿、离心管及Tip头等均用DEPC水处理后,在120℃下高压灭菌30min2次, 60℃ 烘干备用。
 
1.2.2 RNA提取 将冻存的植物组织分为2组:组I使用多样品组织研磨仪处理。使用时先将样品和研磨球装入旋盖式不锈钢研磨罐,并将研磨罐浸入液氮或低温冰箱中。待充分冷冻后将研磨罐固定在“Tissuelyser”研磨机的快速锁紧装置上。旋盖式的研磨罐尤其适合用于低温研磨。因其经研磨后仍有很好的气密性直**重新回**室温。这样就能防止空气中的水份在冷冻样品上的冷凝。组Ⅱ用传统的研磨方法迅速研磨成粉末。
 
收集研磨的粉末,分别加入1ml冰预冷的抽提缓冲液(1ml抽提缓冲液中预加入0.01mlβ-巯基乙醇),震荡混匀;加入0.5ml 水饱和酚,震荡混匀,室温离心15min, 12 000r/min;吸上清**新管,加入0.5mlPCI,震荡混匀,室

温离心15min,12 000r/min;吸取上清,加入等体积CI,震荡混匀,室温离心15min,12 000r/min;吸取上清,加入0.2倍体积的1mol/L 冰醋酸,0.7 倍体积的冰预冷的无水乙醇,震荡后置于-70℃ 保存1h,4℃ 离心15min,12 000r/min;弃上清,加入3mol/L 冰预冷的NaCl重悬沉淀,4 ℃ 离心15min,12 000r/min;加入0.5ml 70%(v/v)的冰预冷的乙醇清洗沉淀,4 ℃ 离心15min,12 000r/min;弃上清,37℃干燥沉淀,加入0.05 ~ 0.1ml DEPC水溶解沉淀,65℃放置 10 ~ 20min,-70℃冻存。
 
1.2.4 RNA检 测 利用紫外分光光度计测定RNA样品在OD230、OD260、OD280nm波长下的吸光值,并计算OD260/ OD230、OD260/OD280。计算样品总RNA的质量浓度=OD260*40mg/L*稀释倍数(mg/L);计算样品总RNA的得率=总RNA的质量浓度*原液体积/提取样品量(μg/g)[8]
 
RNA的琼脂糖凝胶电泳:样品用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳后,EtBr 染色,紫外灯下观察,可分辨出2 ~ 4条带。
2 结果与分析
 
2.1 RNA得率和纯度
 
利用盐酸胍法从不同植物组织中提取RNA,分别测
 
定其OD230、OD260、OD280nm值如表1所示,组I和组 Ⅱ 的OD260/D280值为1.8 ~ 2.1,表 明两种方法处理所得到的总RNA较纯,没有蛋白质和酚等的污染,RNA得率为50 ~ 200μg/g,组I比组Ⅱ得率要高。此外不同组织总RNA的含量不同,其中:根和茎的总RNA量较低,得率范围为39 ~ 64μg/g;叶和花蕾的总RNA含量较高,得率在 156 ~ 200μg/g。 
2.2 RNA的完整性
 
用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,结果出现两条
 
清晰的28S rRNA 和18S rRNA条带,说明2种方法处理所得到的总RNA未降解。28S rRNA条带的亮度约是18S rRNA 的2倍。
3 讨论
 
“Iissuelyser”系列研磨机采用了特殊的垂直上下震动模式,通过研磨(氧化锆、钢珠、玻璃珠、陶瓷珠)的高频往复震动、撞击、剪切,快速实现目的,使研磨的样品具有更加充分、更均匀、样品重复性更好、样品之间没有交叉污染。通过以上实验,多样品组织研磨仪在菊科植物组织中总RNA提取的应用与传统方法比较具有很多优势,具体总结如下:
3.1 操作数量多,效果好
 
高效快速的工作可以在1min内完成2*24,2*48,4*96
 
个样品的研磨。与传统研磨方法相比,省时、省力,批间、批内差异小。由表1可以看出,总RNA质量浓度和总RNA得率结果都要优于常规方法。
3.2 无交叉污染
 
样品管在破碎过程中处于全封闭状态,可以采用一次
 
性离心管和珠子。样品完整保留在管内,避免样品间的交叉污染以及外界污染。
3.3 操作简便
 
内置程序控制器,可对研磨时间、转子的震动频率等参
 
数进行设置;人性化的操作界面。
 
3.4 稳定性好
其生长。因此,在花生基本齐苗后,用小锄扒开幼苗周围的土,使2片子叶露出土外见到阳光,能促壮生长,早开花下锥,提高结果率。清棵后15 ~ 20d进行中耕除草,可增产10%以上。
5.3 促
 
“促”即根据外喷肥,补充营养,促进生长。花生进入花针期需肥量较大,养分不足会造成植株生育不良。进入开花期喷洒2% ~ 3%尿素溶液50kg增产明显,花生后期喷磷一般增产15%以上。每667m2每次喷洒2% ~ 4%的磷酸二铵溶液40 ~ 50kg,间隔7 ~ 10d喷1次,连喷2 ~ 3次。
5.4 控
 
在盛花末期,当植株生长旺时(生长指标是植株高度
 
超过40cm,**对侧枝8 ~ 12节,长度超过5cm)应当进行控旺防倒。具体措施如下:①在盛花末喷施浓度1 000mg/kg 的B9溶液;②在盛花期喷施浓度100mg/kg的缩节胺溶液;③在盛花后期喷施浓度100 ~ 200mg/kg的多效唑溶液;④在盛花期喷施浓度300mg/kg的粉锈宁溶液防叶斑病、白粉病。
 
以上药液用量为每667m2每次50kg,应注意无论喷哪种药剂,都要严格掌握浓度、用量和喷施时间,以免发生药害。地力差的田块不宜使用,喷后24h遇雨重喷。
5.5 灌
 
花生生育中期正是营养生和与生殖生长并进时间,
 
是花生需水**多的时期。当地表土5cm土壤含水量不足10%时,可在中午花生叶片出现翻叶现象时及时进行浇水。采用小水润灌,防止大水慢灌,避免因湿度过大造成烂果烂叶,浇水时间一般掌握在早晨或傍晚。花生进入饱果期后,水分消耗逐渐降低,一般保持田间**大持水量的 50% ~ 60%为宜,低于40%时应浇“跑马水”,雨水偏大时应及时排涝。
5.6 培

“培”即培土。培土的**佳时间应掌握在大批果针入土时进行,其具体方法是:在花生行间铲土,封在花生两侧,垄顶要平宽,切忌培成脊,这样使明水能排,暗水能渗,培土的作用就是缩短果针与土壤间的距离,使果针及早入土,提高座果率,从而达到增产的目的。
5.7 病虫害防治
 
(1)播种前整地时,每667m2用博士一袋净1.5kg均匀撒在地表耙入土中,防治金针虫、蛴螬效果可达90%以上。
 
(2)苗期每667m2用50%辛硫磷或40%甲基异柳磷 150 ~ 200g,加水7.5 ~ 10kg和40kg过筛细土混匀撒在花生墩附近,后锄松土壤覆盖,可防治蛴螬为主的地下害虫,效果可达80%。当有蚜株率达15%,百株蚜量达200头以上时,可用1 500倍液的大功臣或600倍液的绿亨杀杀死喷雾防治,效果可达95%以上。
 
(3)花生中后期易发生叶斑病、茎腐病、叶枯病,又名花生死棵病,于发病初期亩用绿亨一号2袋或绿亨三号2袋加水喷雾或每667m2喷800倍液的甲基托布津,7~10d喷1次,连喷2 ~ 3次,防效可达95%以上。
6 适时收获
 
夏播花生10月上旬,植株上部叶片变黄,大部分荚果果壳硬化,网纹清晰,果壳内壁发生青褐色斑片,籽仁饱满,种皮有光泽时,应及时收获。收的过早过晚都影响产量和品质。
参考文献
 
[1]江贤国.花生栽培技术与提高种植效益的措施[J].农技服务,2008
 
(10). [2]侯建芳,陈向云.赵晓丽.宝丰县夏播花生高产栽培技术[J].现代农
 
业科技,2010(06). [3]张平湖,刘冠明.花生杂种F1代杂种优势的初步分析[J].安徽农业

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